体外构建复杂3D细胞架构是组织工程与再生医学的核心需求，但传统方法（如手动堆叠、磁悬浮、3D打印）存在低通量、依赖支架/特殊设备、细胞损伤风险高等问题，难以满足精准化、高通量研究需求。Droplet microarray（DMA）平台凭借超微量反应（200 nL/斑点）、无支架培养的优势，为解决这一难题提供了新思路。本研究基于DMA开发“可编程相邻液滴融合（proMAD）”方法，通过I.DOT非接触式纳升级移液系统精准控制液滴融合，实现2-6个细胞球体的高通量组装，成功构建同源/异源多球体结构，并用于Wnt信号传播研究，为细胞间通信、癌症侵袭等基础生物学研究提供了革新性工具。
实验方法
01、核心平台与材料设计
采用超疏水-亲水界面构建的DMA芯片（7.5×2.5 cm，含14×14个1 mm × 1 mm独立亲水斑点，间距500 μm，图1），选取HepG2、HEK293T、HeLa RFP等细胞，以DMEM为基础培养基，通过“悬滴法”形成细胞球体，再通过液滴融合构建多球体架构；以Wnt-3a分泌细胞（HEK293T-Wnt3a）和Wnt报告细胞（HEK293T-TOP-GFP）验证信号传播功能。
展开剩余86%图1. 相邻液滴的可编程合并(ProMAD)。a)使用带有由超疏水边界划分的亲水斑点的微型液滴微阵列(DMA)的悬滴法形成细胞球体阵列的示意图。为了实现椭球体的可编程组装，通过增加相邻液滴的体积来合并液滴。b)14×14单个HepG2球体阵列的显微镜图像。c，f)DMA上多个液滴可控合并的打印方案。使用以下印刷体积：每滴900 nL，用于融合2或4个液滴；每滴850 nL，用于将3个液滴融合在一起((c)和(f)中的蓝点)。d，g)DMA的显微镜图像，其中包含2、3和4个合并的液滴，其中包含球体。e，h)融合后24小时融合液滴中4个球体和3个球体的图像
02
实验操作与I.DOT核心应用
单球体制备：通过I.DOT非接触分配器将200 nL细胞悬液（如HepG2，2×10⁶cells/mL）精准打印至DMA亲水斑点，立即倒置芯片形成“悬滴”，利用重力驱动细胞聚集，培养2天自发形成单球体（直径30-150 μm，可通过I.DOT调整细胞数量控制大小，（图1a、b）。
可编程液滴融合：通过I.DOT向相邻斑点的200 nL液滴中添加培养基（融合2-4个液滴时加900 nL/斑点，融合3个液滴时加850 nL/斑点），使液滴跨越超疏水边界自发融合，倒置芯片后相邻球体接触并形成多球体结构（图1c-h；图1流程第二步）。
检测与验证：融合后通过荧光显微镜（Keyence BZ-9000）观察球体形态变化，confocal显微镜（Zeiss LSM 800）检测细胞标记（如RFP/GFP、E-钙黏蛋白），扫描电镜（SEM）观察细胞间接触，qPCR和免疫染色（DAPI、E-钙黏蛋白抗体）验证细胞活力与相互作用；Wnt信号实验中，通过I.DOT打印Wnt分泌细胞与报告细胞至相邻斑点，融合后检测GFP荧光强度（图2a；图2流程）。
图2. 合并的球体之间的WNT信号。 a)使用生产者球体(HEK 293T，WNT-3a)和报告球体(HEK 293T，TOP-GFP)的多球体复合体的WNT信号传播系统的示意图。 b)显示报告球体激活的曲线图。通过共聚焦图像中GFP荧光的强度来评估激活情况。(GFP强度是从至少10个合并的球体计算得出的。*，P<；0.001，单向方差分析)。 c)共聚焦图像显示由绿色荧光蛋白荧光估计的报告球体中Wnt/β-catenin信号的激活。i)HEK 293T球体(对照)和报告球体的合并球体。白色箭头指向微弱的GFP荧光。ii)一个WNT生产者球体(HEK 293T)和一个WNT报告球体(HEK 293T，top-GFP)的合并球体。白色箭头指向WNT传播的方向。d，e)两个研究的三重球体的示意图和荧光显微镜图像，其中一个Wnt产生球体(HEK 293T)和两个Wnt报告球体(HEK 293T，top-GFP)。f)显示(d)中所示的三重球体的白色虚线上的GFP强度分布的曲线图。g)显示沿(e)中所示的三重球体的白色虚线的GFP荧光强度分布的曲线图。
实验结果
01、单球体形成与可编程融合：I.DOT 精准控制架构组装
通过I.DOT打印200nL细胞悬液，HepG2细胞在悬滴中2天内自发形成圆形度＞0.87、紧实度＞0.96的单球体；利用I.DOT添加培养基可精准控制2-4个相邻液滴融合，形成“双球体”“三球体”“四球体”等多结构（图1d、g、h），例如2个液滴融合后24h形成“花生状”复合体，96h完全融合为椭圆形结构（图1e；图3a）。融合过程中，球体接触角从2h的57°±16°逐渐增至96h的180°，融合区域“颈部”长度从40.7±6.8 μm增至138±10 μm，与3D细胞相互作用模拟结果高度一致（图3b、c、d），证明I.DOT可通过剂量控制实现多球体的可编程组装。
图3.两个细胞球体融合过程的实验与模拟研究。a)首次接触后超过96小时的两个HepG2球体融合的明场显微镜图像。b)合并球体之间的夹角随时间变化的曲线图。角度由(a)中的蓝色虚线表示。c)显示一段时间内合并椭球体的颈部长度的曲线图(橙色虚线，如(a)所示)。(b)和(c)中的误差条表示来自10个不同合并球体的SD。d)对两个球体(直径150微米，400个细胞)的融合过程进行三维模拟。e)热图显示融合过程中单个细胞的时空运动。颜色图指示每个单元格相对于其初始位置(t=0)的位移。KMCS是时间尺度，代表千克蒙特卡罗扫荡。
02、同源/异源多球体构建：覆盖多样化3D细胞架构需求
proMAD方法可构建两类多球体结构：①同源多球体（如HepG2三球体），存在“线性（A₁A₂A₁，概率61%）”和“三角形（A₂A₂A₂，概率39%）”两种组合（图4a）；②异源多球体（如HeLa RFP与HEK293T-GFP组合），通过I.DOT分别打印两种细胞至相邻斑点，融合后形成A₁B₁双球体、A₁B₂B₁三球体等结构，24h后仍保持清晰细胞边界（图4b），满足异质性组织模拟需求。
图4.由proMAD方法形成的多球体结构的例子。a)不同的HepG2多球体的示意图、概率和相应的例子。与复合体的各个球体之间的结合位点数相对应的“结合数”显示在方案上的每个球体中。α，在理论模型中，将细胞球体视为球体，并通过模拟算法给出组合概率。β，综合概率由实验统计得出(3个球体，n=33和4个球体，n=32)。b)由两种不同的细胞系(表达RFP和HEK293T的HeLa细胞，绿色荧光5-氯甲基荧光素二醋酸酯染色)合并24h后构建的异球形结构的荧光显微镜图像：A1B1，A1B2B1，A2A2B2和A2B2B3A1。
03、细胞间相互作用验证：无支架架构的生物学稳定性
免疫染色显示，融合后的多球体中，E-钙黏蛋白在球体界面均匀分布（图5a），证明细胞间形成成熟黏附连接，排除物理吸附；SEM观察到球体界面细胞紧密接触，“颈部”区域细胞连接完整（图5b）；活死染色（Calcein-AM/PI）显示融合后细胞活力＞90%，确认无支架架构的生物学稳定性。
图5. 多椭球结构内的细胞-细胞相互作用。a)融合后24h的两个HepG2球体的荧光显微镜图像。E-钙粘素染色(绿色荧光)显示细胞间连接。DAPI(蓝色荧光)表示细胞核。合并：DAPI覆盖，E-钙黏蛋白染色。b)融合球体(HepG2，融合后24h)的扫描电子显微镜图像。左图为放大2000倍的图像。右上角(蓝色方框)7000倍放大显示单个球体的细胞-细胞接触。右下角图像(橙色框)在7000倍放大时显示双球体的接触“颈部”区域。
04
Wnt 信号传播研究：多球体架构的功能应用
利用proMAD构建“Wnt分泌球体-报告球体”异源结构：通过I.DOT打印HEK293T-Wnt3a（分泌细胞）与HEK293T-TOP-GFP（报告细胞）至相邻斑点，融合后24h报告球体GFP强度为对照组的15倍，48h达20倍，且整个报告球体荧光均匀（图2b、c）；三球体结构中，Wnt信号可传播103±21 μm，直接相邻的报告球体激活更强（图2d-g），证明该架构可精准量化细胞间信号传播，为3D环境下的信号机制研究提供新模型。
总结与讨论
本研究基于Droplet microarray（DMA）平台开发的可编程相邻液滴融合（proMAD）方法，借助I.DOT非接触分配技术实现了3D多球体细胞架构的高通量、可编程构建，核心突破集中于精准可控性与多维度优势的集成。在精准性上，I.DOT不仅能实现200 nL细胞悬液的均一打印，确保单球体形态（圆形度＞0.87、紧实度＞0.96）与大小（30-150 μm）的一致性，还可通过精准添加850-900 nL/斑点的培养基控制液滴融合，有效解决了传统方法“融合不可控、细胞分布不均”的痛点，成为多球体架构可编程组装的关键支撑；在综合优势上，proMAD相比手动堆叠、磁悬浮等传统技术，兼具超微量（200n L/球体，细胞用量仅为96孔板的1/50）、无支架（避免支架对细胞信号的干扰）、高通量（单芯片可同步开展百组实验）及兼容多成像技术（荧光显微镜、SEM、confocal）的特点，尤其适用于原代细胞、干细胞等稀缺细胞的3D培养与研究。
从功能化应用价值来看，本研究通过Wnt信号传播实验充分验证了proMAD构建的多球体架构的生物学研究潜力——融合后的“Wnt分泌球体-报告球体”异源结构中，报告球体GFP荧光强度24h内达对照组的15倍、48h达20倍，且信号传播距离可精准量化（103±21 μm），为3D环境下细胞间信号机制研究提供了可靠模型。未来该方法还可拓展至癌症侵袭（构建肿瘤-基质细胞多球体）、胚胎发育（模拟多细胞分化）、药物筛选（评估药物对3D细胞互作的影响）等领域[1,2]，为基础生物学与转化医学提供“接近体内环境”的研究工具。总体而言，I.DOT与DMA的协同结合，不仅革新了3D细胞架构的构建方式，更推动了“微型化、高通量、功能化”细胞研究的发展，为解析复杂细胞互作机制提供了全新范式。
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